糖尿病已成為全球高發(fā)慢性疾病，其中 1 型及晚期 2 型糖尿病患者需長(zhǎng)期依賴(lài)胰島素治療。但傳統(tǒng)胰島素給藥方式存在致命缺陷：開(kāi)放式注射系統(tǒng)劑量精準(zhǔn)度低，易引發(fā)低血糖風(fēng)險(xiǎn)；電子閉環(huán)設(shè)備（如胰島素泵）成本高、需定期校準(zhǔn)，且存在生物污染隱患。
理想的糖尿病治療方案，應(yīng)像健康人胰腺一樣——血糖升高時(shí)自動(dòng)釋放胰島素，血糖正常時(shí)減少分泌。近期，印度賈瓦哈拉爾?尼赫魯高級(jí)科學(xué)研究中心（JNCASR）Govindaraju 團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種葡萄糖響應(yīng)型可注射絲素蛋白水凝膠（SFBGH），僅需皮下注射，即可模擬胰腺功能實(shí)現(xiàn)胰島素 “按需釋放”，在1型糖尿病大鼠模型中成功將血糖維持在正常水平達(dá) 36 小時(shí)。這一成果為糖尿病精準(zhǔn)治療提供了全新思路。
研究?jī)?nèi)容
絲素蛋白（SF）具有優(yōu)異的生物相容性與可降解性，其親水域含可功能化氨基酸。團(tuán)隊(duì)通過(guò)苯硼酸（PBA）功能化修飾絲素蛋白，賦予材料葡萄糖響應(yīng)能力。具體的，通過(guò)4 - 羧基苯硼酸 - N - 羥基琥珀酰亞胺酯（CPBA-NHS）與 SF 的賴(lài)氨酸、絲氨酸共價(jià)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)苯硼酸（PBA）功能化修飾（SFB）（圖1 A），當(dāng)血糖升高時(shí)，葡萄糖與PBA結(jié)合，破壞水凝膠內(nèi)部交聯(lián)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)胰島素釋放。SFB在 37°C 下 30-60 分鐘（1.5% 濃度）即可形成水凝膠（SFBH），遠(yuǎn)快于原始SF（需數(shù)周），因 PBA 促進(jìn)苯硼酸酯形成與 β- 折疊結(jié)構(gòu)，二者協(xié)同交聯(lián)加速凝膠化（圖1 B）。通過(guò)傅里葉變換紅外光譜（FTIR）驗(yàn)證了絲素蛋白的硼酸功能化及其在凝膠化過(guò)程中的構(gòu)象轉(zhuǎn)變（圖1 C）。最后將葡萄糖氧化酶（GOx）、胰島素包封其中形成 SFBGH，不影響凝膠化且能均勻成膠，GOx 可依葡萄糖濃度生成 H?O?，促使硼酸酯解離以控釋胰島素。
圖1.苯硼酸修飾絲素蛋白自組裝成膠過(guò)程與紅外光譜分析圖
利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）觀察水凝膠的形態(tài)，圖像顯示SFBH基質(zhì)具有高度多孔結(jié)構(gòu)，適合藥物包封，孔隙周?chē)鸀榻宦?lián)的絲素蛋白聚集層，水凝膠基質(zhì)內(nèi)部存在大量封閉孔隙，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖變化的多輪響應(yīng)，放大圖像顯示聚集層為高度緊密堆積結(jié)構(gòu)，無(wú)微小孔隙（圖2 A）。能量色散 X 射線(xiàn)（EDX）分析顯示，硼元素在水凝膠基質(zhì)中均勻分布（圖 2B），水凝膠的這種多孔形態(tài)和緊密堆積結(jié)構(gòu)，滿(mǎn)足了藥物大量負(fù)載和緩釋動(dòng)力學(xué)的需求。
通過(guò)流變學(xué)研究評(píng)估水凝膠的機(jī)械特性，動(dòng)態(tài)頻率掃描（0.1-100 rad/s）顯示，SFBH表現(xiàn)出良好的機(jī)械性能，此主要?dú)w因于絲素蛋白的β- 折疊結(jié)構(gòu)（圖2 C）。粘度測(cè)量水凝膠表現(xiàn)出明顯的剪切變稀特性（圖2 D）。隨時(shí)間變化的剪切依賴(lài)性粘度曲線(xiàn)證實(shí)了水凝膠的觸變性，支持其作為可注射水凝膠的適用性（圖2 E）。這些特性確保了水凝膠用作微創(chuàng)治療給藥的可行性。
圖2.SFBH的微觀形態(tài)、元素分布及流變性能表征圖
為驗(yàn)證 SFBGH 實(shí)用性，評(píng)估其包裹的GOx酶活性：GOx氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸 - 1,5 - 內(nèi)酯（水解降 pH）與 H?O?（圖 3A）；SFBGH 與 PBS、1mg/mL 及 5mg/mL 葡萄糖孵育，僅含葡萄糖組 pH 隨濃度下降（1mg/mL 組 pH 降至 6.5 飽和，5mg/mL 組降至約 4），證實(shí) SFBH 保留GOx活性（圖 3B）；每24小時(shí)換葡萄糖液，培養(yǎng)基 pH 持續(xù)下降，表明 SFBGH 多次葡萄糖波動(dòng)下仍保 GOx 活性（圖 3C）。
圖3 D表明水凝膠結(jié)構(gòu)變化與胰島素釋放的關(guān)聯(lián)。通過(guò)FITC標(biāo)記胰島素實(shí)驗(yàn)，證實(shí)胰島素釋放隨葡萄糖濃度升高而增加（圖3 E）；通過(guò)外部添加不同濃度 H?O?，明確了 H?O?介導(dǎo)的苯硼酸交聯(lián)斷裂是胰島素響應(yīng)性釋放的關(guān)鍵（圖3 F）。
通過(guò)Bradford法進(jìn)一步分析水凝膠中天然胰島素的葡萄糖響應(yīng)性釋放，實(shí)驗(yàn)表明天然胰島素的釋放速率比 FITC - 胰島素快（圖3 G）；圓二色譜顯示釋放的胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)與天然胰島素一致，表明 SFBH 可保留胰島素功能構(gòu)象（圖3 H）；以未修飾的原始絲素蛋白水凝膠（SFH）為對(duì)照，其在 1mg/mL 和 5mg/mL 葡萄糖下胰島素釋放速率無(wú)差異（圖 3I），證實(shí)絲素蛋白與 PBA 的共價(jià)修飾是實(shí)現(xiàn)葡萄糖響應(yīng)性釋放的必要條件。最后模擬胰腺 β 細(xì)胞脈沖分泌特性，交替使用 5mg/mL 和 1mg/mL 葡萄糖，SFBGH 的胰島素釋放量隨葡萄糖濃度降低而減少，且該模式可重復(fù)，表明其在高血糖時(shí)能模擬人工胰腺遞送適量胰島素（圖 3J）。
圖3.SFBGH 中葡萄糖氧化酶活性驗(yàn)證、胰島素濃度依賴(lài)性釋放及脈沖分泌功能評(píng)估
為了評(píng)估葡萄糖響應(yīng)性水凝膠的可控治療遞送效果，研究團(tuán)隊(duì)建立了1型糖尿病大鼠模型并進(jìn)行了對(duì)比測(cè)試（圖4 A）。實(shí)驗(yàn)表明， 載胰島素SFBGH（iSFBGH）能在2h內(nèi)降低血糖，并將正常血糖水平長(zhǎng)時(shí)維持（36h），說(shuō)明SFBGH作為葡萄糖響應(yīng)型載體，可實(shí)現(xiàn)胰島素的長(zhǎng)效可控釋放，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)胰島素溶液及非響應(yīng)型水凝膠（圖4 B）。進(jìn)一步對(duì)比初始12h各組的降糖速度與早期穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，iSFBGH組兼顧較快的降解速度（2h達(dá)標(biāo)）與早期血糖穩(wěn)定性，可避免由短期血糖波動(dòng)引發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)（圖4 C）。
通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量測(cè)試（IPGTT），模擬餐后血糖驟升場(chǎng)景，對(duì)比健康大鼠與各處理組糖尿病大鼠的血糖響應(yīng)能力。結(jié)果顯示，iSFBGH 組能有效抑制血糖驟升幅度，30min 時(shí)血糖峰值顯著低于其他糖尿病組，并在1.5h內(nèi)恢復(fù)至正常血糖水平，證明 iSFBGH 可改善糖尿病大鼠的血糖調(diào)節(jié)能力，接近健康大鼠的生理響應(yīng)模式（圖4 D）。通過(guò)計(jì)算 IPGTT 實(shí)驗(yàn)中血糖響應(yīng)曲線(xiàn)下面積（AUC），對(duì)各處理組的血糖調(diào)節(jié)效果進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，iSFBGH 組的 AUC 值顯著低于其他糖尿病處理組，且與健康大鼠組的差異最小，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度量化證實(shí)了 iSFBGH 在改善糖尿病大鼠葡萄糖耐受能力、恢復(fù)血糖穩(wěn)態(tài)方面的優(yōu)勢(shì)（圖 4 E）。
圖4.載胰島素SFBGH在糖尿病大鼠中的降糖功能評(píng)估
總結(jié)與展望
本研究成功開(kāi)發(fā)了一種葡萄糖響應(yīng)性絲素蛋白水凝膠（SFBGH），該水凝膠具有多孔形態(tài)和高度交聯(lián)的絲素蛋白組裝結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)節(jié)包裹GOx的功能活性，并實(shí)現(xiàn)葡萄糖響應(yīng)性基質(zhì)降解。在高血糖條件下，水凝膠可通過(guò)結(jié)構(gòu)重排，實(shí)現(xiàn)胰島素的高效包埋與釋放。在糖尿病Wistar大鼠皮下注射該水凝膠，可實(shí)現(xiàn)胰島素的可控遞送并能長(zhǎng)期維持正常血糖水平。本研究開(kāi)發(fā)的SFBGH可作為閉環(huán)人工胰腺用于胰島素可控遞送，為糖尿病精準(zhǔn)治療提供新方案，且絲素蛋白原料易獲取、易加工，具良好的應(yīng)用前景。
原文鏈接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.3c07060
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